Con questo numero di SIF notizie desideriamo iniziare una nuova rubrica che abbiamo senza fantasia intitolato "Racconti dei borsisti".
Le ragioni di questa rubrica sono ovvie:
1) Far sapere a tutti i soci come sono stati spesi i soldi delle borse
di perfezionamento assegnate dalla SIF nel semestre o nell'anno precedente.
2) Dare a chi ha usufruito di questi contributi la possibilità
di raccontare in modo sintetico, ma libero, la sua esperienza scientifica
e umana all'estero
Ci auguriamo così che queste "relazioni" non siano solo momento di rendiconto (comunque importante), ma possano documentare la vivacità scientifica dei giovani farmacologi.
Alessandro Mugelli
Nel nostro laboratorio presso l'Istituto di Scienze Farmacologiche di Milano abbiamo identificato un nuovo recettore P2Y per ATP, la cui attivazione porta ad astrogliosi reattiva. Segni di gliosi reattiva sono presenti in patologie neurologiche di tipo acuto (trauma, ictus, ischemia) e cronico (Alzheimer, Parkinson). Nell'ambito del programma del Dottorato di Ricerca in Tossicologia dell'Ambiente e dell'Alimentazione, (coordinatore: Prof. Flaminio Cattabeni), avevo in precedenza dimostrato che analoghi dell'ATP quali abmeATP, sono in grado, mediante questo nuovo recettore P2Y, di mimare in vitro il fenomeno della gliosi reattiva e di indurre, parallelamente, un aumento della sintesi della proteina ciclo-ossigenasi-2 (COX-2), enzima recentemente coinvolto nell'eziopatogenesi delle malattie sopra menzionate. Nel laboratorio del Prof. Joseph Neary ho approfondito i meccanismi alla base dell'induzione di COX-2 da parte di ATP. Mediante RT-PCR semiquantitativa, ho dimostrato che l'espressione genica di COX-2 è sensibilmente incrementata dopo trattamento con abmeATP e sembrerebbe dipendente dall'attivazione di MAP kinasi. Tramite "electrophoretic mobility shift assay" ho inoltre dimostrato che a,bmeATP determina un incremento del legame per il complesso AP-1, che potrebbe indurre la trascrizione diCOX-2 legandosi alla sequenza consenso presente sul promotore del gene. In conclusione, questo studio suggerisce la possibilità di un nuovo approccio farmacologico alla terapia delle patologie neurodegenerative a componente infiammatoria, vale a dire l'utilizzo di antagonisti selettivi per i recettori P2Y in grado di modulare l'espressione dell'enzima COX-2. I risultati di queste ricerche saranno oggetto di almeno due pubblicazioni in extenso su riviste internazionali con impact factor.
Roberta Brambilla
Anche grazie al contributo di una borsa per l'estero SIF, è da
più di un anno che lavoro nel laboratorio del Prof. R.W. Tsien presso
la Stanford University, occupandomi del filtro di selettività dei
canali del calcio voltaggio dipendenti (VDCC), una regione funzionalmente
importante perchè coinvolta nel determinare la selettività
ionica del canale, bersaglio di agenti tossici e, probabilmente, collocata
sulla via di accesso di farmaci di largo impiego quali le diidropiridine.
Studi precedenti hanno dimostrato che quattro glutammati presenti in tale
regione sono responsabili della selettività dei VDCC di tipo L.
Il recente cloning dei canali T, una famiglia di VDCC con proprietà
di permeazione diverse da quelle dei canali L, ha dimostrato che il filtro
di selettività di questi canali presenta due glutammati e due aspartati
invece di quattro glutammati. Di qui l'idea di stabilire l'effettivo ruolo
dei glutammati del filtro di selettività nella permeazione ionica
mediante l'analisi del comportamento di mutanti dei canali T, con filtro
di selettività simile a quello dei canali L e viceversa. I risultati
ottenuti ci hanno permesso di riconoscere che, per quanto specifici residui
del filtro di selettività giochino uno specifico ruolo nella permeazione,
i classici quattro glutammati non possono da soli spiegare la totalità
del fenomeno. Grazie all'interazione con un gruppo di rilevanza mondiale,
il mio soggiorno all'estero è risultato di estrema utilità
perchè mi ha permesso di crescere notevolmente nel campo della farmacologia
dei VDCC del quale mi occupo da diversi anni sotto la guida del Prof. Annunziato.
Grazie ancora alla SIF
Mauro Cataldi
Numerosi sono i dati che confermano il coinvolgimento dell'endotelina-1
(ET-1) nell'asma bronchiale.
Scopo del mio lavoro (presso il Department of Pharmacology, del King's
College di Londra, nei laboratori diretti dal Prof. Clive P. Page) è
stato la valutazione,del possibile ruolo svolto dall’ET-1 nella iperreattivita`
delle vie aeree nel coniglio ed una sua eventuale partecipazione ai processi
infiammatori a livello polmonare. Sono stati utilizzati conigli New Zeland
White (NZW) di entrambi i sessi, del peso di 2,5-4,5 kg, di tre mesi di
eta`. I conigli in neuroleptoanalgesia sono stati preparati per testare
la funzione polmonare (resistenze polmonari, compliance dinamica, flusso,
pressione transpolmonare). Gli animali sono stati intubati con un tubo
endotracheale di 3,0 mm per la registrazione del flusso. La pressione pleurica
è stata valutata mediante un catetere posto nel terzo inferiore
dell'esofago con all'estremità un palloncino di latex. Le resistenze
polmonari totali e la compliance sono state calcolate tramite un sistema
computerizzato (Pulmonary Monitoring System). I risultati di questo studio
suggeriscono che l’ET-1 è in grado di indurre iperresponsività
delle vie aeree all’inalazione di istamina senza il coinvolgimento di cellule
infiammatorie a livello polmonare come dimostrato dai risultati ottenuti
dal lavaggio broncoalveolare, ma probabilmente mediante l’attivazione di
fibre C capsaicina sensibili. Inoltre mediante l’uso di agonisti ed antagonisti
selettivi per i sottotipi recettoriali dell’endotelina sembra che l’attivazione
dei recettori ETA, sia in grado di mediare tale fenomeno. Tali dati sono
stati frutto di due pubblicazioni su riviste internazionali: Naunyn - Schmiedeberg’s
Arch. Pharmacol. 5: 561-566, 1998.; In press 1999 e di diverse comunicazioni
a congressi
Bruno D'Agostino
All’inizio del 1996 ho usufruito di una borsa di studio di circa tre
milioni di lire intesa a coprire parte delle mie spese di spostamento negli
Stati Uniti per iniziare la mia attività di ricerca presso il National
Institute of Neurological Disorders and Stroke, al National Institutes
of Health in Bethesda, Maryland USA. Nonostante la natura stessa del finanziamento
non fosse intesa a promuovere specifiche attività scientifiche,
usufruire di tal tipo di supporto mi ha aiutato a iniziare una proficua
attività scientifica che si protrae tutt’oggi. Mi preme sottolineare,
in questa mia relazione, l’importanza di questi piccoli supporti finanziari
che sono di grande giovamento per gli studiosi volontari italiani che intendono
spendere periodi di differente durata all’estero per ulteriore perfezionamento.
Le spese di spostamento rappresentano, talvolta un ostacolo, per coloro
che non dispongono di adeguato ed indipendente supporto economico.
Con la presente, inoltre, voglio formalmente ringraziare la Società
Italiana di Farmacologia per questo piccolo ma al tempo stesso determinante
supporto.
Maurizio Grimaldi
Il progetto di ricerca di cui mi sto attualmente occupando all’Università di Chicago si basa sullo studio del metabolismo in vitro di farmaci antitumorali. In particolare, viene studiata la glucuronazione di agenti chemioterapici nei loro corrispettivi metaboliti inattivi glicuronati. Mediante l’uso di microsomi epatici umani e microsomi derivanti da sistemi eterologhi esprimenti specifiche isoforme enzimatiche, sono state identificate le isoforme responsabili della glucuronazione dei farmaci oggetto della ricerca. Ciò getta le basi scientifiche per la valutazione del ruolo del polimorfismo degli enzimi glucuroniltrasferasici nella chemioterapia antitumorale. La variabilità interindividuale in vitro dell’attività enzimatica in relazione alla produzione dei metaboliti glicuronati è risultata significativa, facendo ipotizzare la presenza di un polimorfismo genetico. Sono stati condotti inoltre studi di correlazione dell’attività enzimatica con specifici substrati per le isoforme glucuroniltrasferasiche responsabili della glucuronazione dei farmaci in studio. Le future ricerche saranno basate sulla identificazione del genotipo glucuroniltrasferasico mediante tecnica PCR effettuata su campioni di fegato umano e sullo studio della relazione esistente tra l’attività enzimatica in vitro e il genotipo ad essa associato. Per i farmaci antitumorali oggetto di studio, la glucuronazione rappresenta la maggiore via di detossificazione, e lo scopo ultimo della presente ricerca è quello di valutare il ruolo di polimorfismi enzimatici su base genetica nella farmacocinetica e farmacodinamica di agenti antitumorali. Gli esempi di farmaci come il 5-fluorourcile, la 6-mercaptopurina, l’amonafide e l’irinotecano suggeriscono che la caratterizzazione delle basi farmacogenetiche del metabolismo di farmaci con basso indice terapeutico può aprire la strada verso l’individualizzazione della dose da somministrare e l’ottimizzazione della terapia.
Federico Innocenti
Grazie ad una Borsa di Ricerca assegnatami dalla SIF nel 1998, ho trascorso 4 mesi presso il Clinical Brain Disorder Branch, la sezione dell'NIH, diretta dal Dr. D.R. Weinberger a Bethesda, per condurre esperimenti mirati a valutare il coinvolgimento dei fattori neurotrofici nella schizofrenia, progetto che discuterò al termine del Corso di Dottorato. I risultati ottenuti presso l'Istituto di Scienze Farmacologiche di Milano avevano dimostrato come, nei ratti, l'espressione di alcuni fattori neurotrofici venisse modulata dai farmaci antipsicotici. Pertanto era di notevole interesse studiare se tali fattori fossero alterati anche in un modello animale di schizofrenia. La nostra attenzione si è focalizzata verso quei modelli sviluppati in base all'ipotesi del "neurosviluppo", che suggerisce che alterazioni del normale programma di sviluppo del sistema nervoso centrale possono concorrere all'insorgenza della schizofrenia. In particolare il modello animale ottenuto dai Dr. Lipska e Weinberger lesionando l'ippocampo ventrale di ratti al 7° giorno di vita postnatale mediante acido ibotenico, era quello più indicato per i nostri studi. Dopo la pubertà tali animali presentano anomalie comportamentali simili a quelle riscontrabili nella schizofrenia. Durante questo stage ho appreso diverse metodologie (la tecnica adottata per lesionare gli animali e per valutarne la corretta esecuzione), ho condotto una serie di esperimenti i cui risultati, presentati ad alcuni congressi, costituiranno la base di prossime pubblicazioni. Inoltre lo stage mi ha permesso di confrontarmi con una realtà ricca di stimoli, nonchè di instaurare collaborazioni che mi consentiranno di ritornare dal gennaio 2000 nello stesso laboratorio per un periodo almeno biennale.
Raffaella Molteni
Il progetto di ricerca è stato condotto presso il laboratorio di “Pharmacologie et Physicochimie des Interactions cellulaires et Moleculaires, Université Louis Pasteur et CNRS, Faculté de Pharmacie”, Strasburgo, Francia. Lo studio ha riguardato le modificazioni della reattività vascolare e dei meccanismi che sottendono tali disfunzioni vascolari in condizioni infiammatorie generalizzate, come quelle da shock settico. In particolare, lo studio ha avuto lo scopo di valutare il coinvolgimento della poli-ADP-ribosio-polimerasi (PARP) nella iporeattività vascolare in uno stato di shock settico, indotto in animali geneticamente modificati (PARP knockout) e nei rispettivi wild-type ed in che modo il fenotipo PARP knockout possa influenzare la produzione di ossido nitrico (NO) in risposta ad immunostimolazione con LPS, dal momento che recenti studi hanno indicato la partecipazione di questo enzima nelle risposte infiammatorie, evidenziando come, a concentrazioni molto elevate di perossinitriti, il meccanismo citotossico PARP-mediato diventi predominante. I risultati del mio studio hanno messo in evidenza come utilizzando inibitori specifici della iNOS e della guanilato ciclasi, solo nel ceppo selvatico l'NO, iperprodotto dalla iNOS, sembra contribuire alla regolazione del tono vascolare di anelli di aorta dopo trattamento con LPS. Gli esperimenti di contrazione sono stati poi confermati dai risultati del western blotting che hanno evidenziato la presenza della iNOS negli animali wild-type e la completa assenza nel ceppo mutante Tali dati indicano, quindi, come l’assenza dell’enzima PARP possa essere responsabile di una certa resistenza allo shock endotossico e come l’inibizione farmacologica di tale enzima possa essere vista come una possibile strategia terapeutica in corso di shock settico. Questa esperienza ha portato i suoi vantaggi anche in termini di pubblicazioni, in quanto i dati sopraesposti sono già stati inseriti in un lavoro pubblicato su EMBO Journal dal titolo: “Resistance to endotoxic shock as a consequence of defective NF-kB activation in poly (ADP-ribose) polymerase-1 deficient mice” EMBO J Vol.18 No.16 pp.4446-4454, 1999.
Carmela Nacci
Lo studio da me condotto nei precedenti anni di ricerca dimostrava la
presenza, nel cervello di ratto, di un difetto di attivazione età-correlato
della protein chinasi C (PKC) ed il coinvolgimento di proteine di ancoraggio
in questo deficit funzionale. Inoltre, alterazioni del sistema chinasico
C e delle proteine di ancoraggio ad esso associate erano state dimostrate
nel cervello di pazienti con malattia di Alzheimer. Considerando l’importanza
giocata dal calcio quale fattore chiave di regolazione dell’attivazione
della chinasi C, diventava interessante poter studiare, in modelli cellulari
che esprimessero proteine coinvolte nella patologia di Alzheimer, i movimenti
del calcio in risposta a stimoli farmacologici.
Il periodo di ricerca trascorso presso l’Università di Georgetown
sotto la guida del Dr. Renè Etcheberrigaray, usufruendo della borsa
SIF, mi ha consentito di imparare ed applicare la tecnica di imaging del
calcio in un appropriato modello cellulare di studio della malattia di
Alzheimer. Tale tecnica apre sbocchi per indagini sperimentali future volte
a saggiare, in tempo reale, i movimenti del calcio in modelli in vitro
in grado di mimare eventi biochimici associati per esempio a specifiche
patologie o ad alterazioni del sistema di neurotrasmissione.
Frutto di questa collaborazione scientifica sono stati un articolo
riguardante lo studio a cui si faceva riferimento in precedenza ("Enhanced
BK induced calcium responsiveness in PC12 cells expressing the C-100 fragment
of the amyloid precursor protein " - A. Pascale, S.Bhagavan, T.J. Nelson,
R.L. Neve, D.L. McPhie and R. Etcheberrigaray - Molecular Brain Research
72:205-213, 1999) ed una rassegna sul calcio ("Calcium alterations in Alzheimer’s
disease pathophysiology, models and therapeutic opportunities" A.Pascale
and R.Etcheberrigaray - Pharmacological Res. 39 (2): 81-88, 1999).
Alessia Pascale
La sottoscritta Dott.ssa Rosanna Rinaldi, dottoranda di ricerca in “Metabolismo
dei Farmaci e Farmacocinetica” (XI ciclo), vincitrice della borsa di studio
SIF, si è recata a Stoccolma (Svezia) presso il Karolinska Institutet,
Institute of Environmental Medicine, Div. Biochemical Toxicology, sotto
la guida del Prof. Ralf Morgenstern per un periodo di formazione scientifica
di mesi sei nell’anno 1998. Durante tale periodo prorogato per altri sei
mesi, la Dott.ssa Rinaldi si è occupata di uno studio sull’attivazione
del Glutatione-S-Transferase microsomale utilizzando tutte le principali
tecniche biochimiche.
I risultati sono stati promettenti così da poter preparare un
lavoro scientifico dal titolo “Reactivity of Cys-49 and its influence on
the activation of Microsomal Glutathione Transferase 1”. In tale lavoro
è stata descritta la caratterizzazione di proprietà chimiche
del sulfidrile Cys-49 (pKa=7.3*0.07) concludendo che l’ambiente circondante
il glutatione transferasi microsomale 1, abbassa il pKa di almeno un ordine
di grandezza rispetto il sulfidrile libero della cisteina.
Lo studio stechiometrico ha mostrato che le tre subunità della
proteina non funzionano indipendentemente. Lo studio con differenti chinoni
(derivati del benzene) ha mostrato che l’attivazione della proteina avviene
con composti più reattivi e con minore imgombro sterico. Tale attivazione
può essere usata per scoprire reattivi intermedi durante il metabolismo
di composti estranei ma certi intermedi possono passare inosservati. E'
da chiarire se quesi ultimi sono veramente meno tossici.
Rosanna Rinaldi
Nel corso del terzo anno del dottorato di ricerca in Neuroscienze, mi
sono recata presso l’MRC Centre for Brain Repair dell’Università
di Cambridge nel laboratorio di biologia molecolare diretto dalla Professoressa
Maria Grazia Spillantini che da anni si occupa di patologie neurodegenerative
del Sistema Nervoso Centrale ed in particolare della Malattia di Alzheimer.
Importanti sono i suoi studi sul coinvolgimento e sulle alterazioni
biochimiche della proteina tau in queste patologie.
Il principale progetto del quale mi sono occupata è stato lo
studio di dieci famiglie affette da frontotemporal dementia. Sono stati
sequenziati gli esoni 7, 9, 10, 11, 12 e 13 del gene di tau di individui
malati e sani. In due soggetti gemelli monozigoti affetti da FTDP-17 è
stata trovata una mutazione (da C a T) in posizione +16 nell’introne che
segue l’esone 10. Ciò determina una modificazione nella struttura
dello stem-loop nell’introne che segue l’esone dieci ed una conseguente
alterazione nella produzione di tau con tre e quattro repeat. Questa alterazione
è stata trovata nei due gemelli ma non nei soggetti di controllo,
indicando che la mutazione segrega con la patologia. La determinazione
del difetto genetico responsabile della malattia indica che un cambiamento
nella produzione di isoforme di tau con tre o quattro repeats è
perciò sufficiente a portare allo sviluppo di aggregati fibrillari
della proteina tau nelle cellule nervose e gliali determinando la loro
degenerazione e risultando in disordini caratterizzati da demenza.
Pubblicazioni
- Rizzini et al. Tau mutation in familial frontotemporal dementia.
(In preparation)
- M.Tolnay, M. G. Spillantini, C. Rizzini, D. Eccles, J. Lowe, D. Ellison,
Widespread tau pathology in frontotemporal dementia and Parkinsonism due
to 5’-splice site mutation in the tau gene. (Submitted)
Claudia Rizzini
Ho avuto la possibilità, grazie ad una Borsa di Ricerca SIF,
di trascorrere tre mesi (maggio-luglio 1998) presso i Laboratori di Gastroenterologia
della Parke-Davis, MI, USA, diretti dal Dr. Antonio Guglietta.
Durante questo breve periodo ho appreso due tecniche per indurre la
colite ulcerosa nell'animale (TNBS, acido trinitrobenzen sulfonico e DSS,
destrano solfato sodico) e i metodi di studio dei parametri che evidenziano
in modo significativo tale patologia (mieloperossidasi e interleuchina
1-b).
Ho quindi applicato queste metodiche allo studio del ruolo che il sistema
tachichininergico centrale sembra possa avere nell'ambito di tale processo
infiammatorio gastrointestinale, utilizzando due tachichinine naturali
della pelle di anfibio, la PG-SPI e la PG-KII, agonisti rispettivamente
dei recettori NK1 e NK3. I dati ottenuti hanno messo in evidenza che il
sistema tachichininergico centrale NK1 è coinvolto nello sviluppo
dei processi infiammatori dell'intestino, mentre non ancora chiaro appare
il ruolo del sistema NK3.
Tali risultati sono stati presentati al XXIX Congresso Nazionale della
SIF (Firenze, giugno 1999) e al II Congresso Europeo di Farmacologia (Budapest,
luglio 1999).
Alessandra Tabacco
Il pomodoro, uno dei principali costituenti della dieta mediterranea,
dato il suo alto contenuto in flavonoli rappresenta una delle maggiori
fonti di introduzione di questi importanti antiossidanti nell’organismo
umano.
Negli alimenti i flavonoli si trovano principalmente sotto forma di
coniugati, ma il loro contenuto è generalmente espresso come agliconi.
Quindi è importante approfondire la conoscenza del contenuto e del
profilo dei flavonol-coniugati nel pomodoro, specie alla luce delle recenti
osservazioni che hanno evidenziato come il grado ed il tipo di coniugazione
dei flavonol-glicosidi siano fattori molto importanti ai fini del loro
assorbimento a livello intestinale. I trattamenti industriali a cui i pomodori
vengono sottoposti per ottenere prodotti come il succo, la passata, etc.,
producono certamente delle variazioni sia dal punto di vista qualitativo
che quantitativo dei flavonol-glicosidi.
Lo studio intrapreso nei laboratori dell'”Institute of Food Research”
di Norwich (UK) ha riguardato la determinazione del contenuto e del profilo
dei flavonol-glicosidi nel pomodoro e nei suoi prodotti commerciali.
I risultati ottenuti indicano un discreto contenuto in flavonoli ed
un profilo molto vario essendo 11 i composti di interesse purificati ed
identificati mediante tecniche MS ed NMR.
I risultati di questo lavoro sono stati presentati al 5th Int. ESCOP
Symposium (London, October 15-16, 1998) ed al IX Congresso Nazionale della
Società Italiana di Farmacognosia (Modena 21-24 Ottobre, 1998).
Le ricerche in questo settore stanno continuando presso il Dipartimento
Farmaco-Biologico dell’Università di Messina, insieme ad altri studi
volti a chiarire l’efficacia antiossidante “in vitro” ed “in vivo” di questi
composti e la loro biodisponibilità.
Antonio Tomaino